Inhibition de la PCR
L’inhibition de la PCR est une diminution de l’amplification d’un acide nucléique causée par des substances de l’échantillon ou de sa préparation. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) peut alors donner un signal retardé, une quantité sous-estimée ou un résultat négatif malgré la présence de la cible. L’inhibition concerne les performances de l’analyse ; elle ne renseigne pas directement sur l’état sanitaire de l’animal.
Matrices et mécanismes
Le sang, les tissus, les fèces, l’eau et les sédiments n’apportent pas les mêmes interférents. L’hème, certains polysaccharides, la mélanine, les substances humiques, les sels et les résidus de réactifs d’extraction peuvent perturber différentes étapes de l’analyse. La quantité de matrice introduite compte autant que la présence nominale d’un composé : un extrait utilisable à faible volume peut devenir inhibiteur lorsque ce volume augmente.
Certains interférents réduisent l’activité de la polymérase ou modifient les conditions ioniques nécessaires à l’amplification. D’autres se lient aux acides nucléiques ou gênent leur accessibilité. En PCR quantitative, une perturbation de la fluorescence peut en outre modifier le signal mesuré sans bloquer la synthèse d’ADN dans les mêmes proportions. Une baisse du signal ne démontre donc pas à elle seule un mécanisme unique.
L’effet dépend du système analytique. Deux polymérases, deux tampons ou deux cibles peuvent réagir différemment au même extrait. Dans une PCR multiplex, la conservation d’un signal pour une cible ne garantit pas que toutes les autres soient amplifiées avec leur sensibilité attendue.
Contrôles et interprétation
Un contrôle interne d’amplification permet de suivre une cible témoin dans la réaction. Son absence ou le retard de son cycle de quantification, par rapport à une condition non inhibée, signale une perte de performance. Le contrôle doit lui-même être suffisamment sensible à l’inhibition pour que son résultat soit informatif ; une cible témoin très abondante peut rester détectable alors qu’une cible rare ne l’est plus.
Le moment d’ajout détermine ce qui est contrôlé. Une cible introduite dans l’extrait renseigne sur l’amplification et la détection, tandis qu’un contrôle ajouté avant l’extraction peut aussi révéler une perte pendant la préparation. Il faut distinguer une récupération insuffisante de l’acide nucléique, une dégradation de la cible et une inhibition de la réaction. Ces causes peuvent se combiner mais n’appellent pas nécessairement la même correction.
Restaurer une analyse exploitable
Une purification complémentaire, une dilution, un changement de polymérase ou de tampon et certains facilitateurs peuvent réduire les interférences. Leur efficacité se vérifie sur la matrice et la méthode concernées. La dilution réduit simultanément la concentration d’inhibiteurs et celle de la cible ; elle peut donc améliorer une réaction fortement inhibée tout en rendant indétectable un échantillon initialement peu chargé.
La PCR numérique possède elle aussi une sensibilité aux inhibiteurs, même si leur effet et leur distribution entre compartiments diffèrent de la PCR quantitative. Le choix d’une technologie ne dispense pas de contrôles adaptés. Le résultat doit être interprété avec les critères d’acceptation de la méthode et les performances réellement obtenues.
En diagnostic moléculaire, une réaction négative inhibée ne permet pas de conclure à l’absence de l’agent recherché. À l’échelle d’un suivi, des inhibitions non reconnues peuvent diminuer la sensibilité effective et sous-estimer la prévalence apparente. Leur détection et leur traitement font ainsi partie de la traçabilité du résultat.
