PCR multiplex

Une réaction en chaîne par polymérase multiplex, ou PCR multiplex, amplifie plusieurs cibles génétiques dans un même tube grâce à plusieurs couples d’amorces et, selon le format, plusieurs sondes fluorescentes. Elle peut rechercher simultanément plusieurs agents, différencier des variants ou associer une cible diagnostique à un contrôle interne. Le gain de temps et de matière s’accompagne d’interactions absentes d’une PCR simple.

Validation

Les amorces peuvent entrer en compétition pour les réactifs, s’hybrider entre elles ou produire des amplicons non souhaités. Concentrations d’amorces et de magnésium, température d’hybridation, longueur des produits et abondance relative des matrices influencent l’équilibre. Une cible très abondante peut consommer une part des réactifs et diminuer la sensibilité d’une cible rare.

La caractérisation compare chaque cible seule puis dans le mélange. Spécificité analytique, limite de détection, répétabilité et robustesse sont établies pour chaque canal et pour les combinaisons pertinentes de cibles positives. Une performance démontrée en monoplex ne se transpose pas automatiquement au multiplex.

En diagnostic moléculaire, témoins d’extraction, d’amplification, d’inhibition et absence de matrice permettent de localiser les défaillances ou contaminations. Une PCR quantitative multiplex sépare les fluorophores par canaux ; le chevauchement spectral, la compensation et les seuils d’analyse peuvent alors créer des signaux croisés. Les performances dans la matrice et la population d’usage sont plus représentatives que celles obtenues uniquement sur de l’ADN pur.

Un résultat négatif signifie seulement qu’aucune cible n’a été détectée au-dessus des limites de la méthode dans l’échantillon analysé. Mutation au site d’amorçage, inhibition, prélèvement inadéquat ou quantité trop faible peuvent produire un faux négatif. Inversement, la détection d’un acide nucléique ne démontre pas à elle seule la présence d’un agent viable ni son rôle causal.