PCR quantitative
La PCR quantitative (qPCR) est une méthode d’amplification génique qui mesure, cycle après cycle, l’accumulation d’une séquence d’ADN grâce à un signal fluorescent. Le cycle de quantification, noté Cq, diminue généralement lorsque la quantité initiale de cible augmente. Cette relation n’est exploitable que dans le domaine dynamique validé de l’essai.
Quantification et contrôles
Le signal provient soit d’un colorant qui se lie à l’ADN double brin, soit d’une sonde fluorescente spécifique de la cible. Une quantification absolue compare les Cq à une gamme étalon de concentration connue. Une quantification relative compare des échantillons après normalisation, souvent à l’aide de gènes de référence dont la stabilité a été évaluée. L’efficacité d’amplification, la linéarité, la répétabilité, le domaine dynamique, la limite de détection et la limite de quantification déterminent la portée numérique du résultat.
La qualité de l’extraction, la présence d’inhibiteurs, la spécificité des amorces et des sondes ainsi que les témoins sans matrice et positifs conditionnent l’interprétation. Un Cq tardif et irrégulier peut correspondre à une quantité proche de la limite analytique, à une contamination ou à une amplification non spécifique. La qPCR détecte une séquence nucléique, pas nécessairement un microorganisme viable ni une maladie active.
Pour une cible ARN, une transcription inverse produit d’abord un ADN complémentaire : la méthode est alors une RT-qPCR. Les informations MIQE associent au résultat les caractéristiques de l’échantillon, les séquences ciblées, les conditions de réaction, les contrôles et la méthode d’analyse ; elles permettent d’en apprécier la validité et la reproductibilité.
