RT-qPCR
La RT-qPCR associe une transcription inverse, qui convertit l’ARN en ADN complémentaire (ADNc), à une PCR quantitative. Elle sert notamment à détecter des virus à ARN et à étudier l’expression de gènes.
Points critiques
Dans un protocole en une étape, transcription inverse et amplification se déroulent dans le même tube. Un protocole en deux étapes produit d’abord un stock d’ADNc utilisable pour plusieurs cibles. La première approche limite les manipulations, tandis que la seconde offre davantage de flexibilité ; elles n’exposent pas exactement aux mêmes variations techniques.
L’ARN se dégrade sous l’action des ribonucléases et lors d’une conservation inadéquate. Le prélèvement, la stabilisation, l’extraction et l’évaluation de l’intégrité influencent donc la quantité de matrice disponible. Des substances coextraites peuvent inhiber la transcription inverse ou la PCR, même lorsque la cible est présente.
Contrôles et quantification
Un témoin sans matrice révèle une contamination des réactifs, un témoin négatif d’extraction surveille la chaîne de préparation et un contrôle positif vérifie que l’essai peut détecter sa cible. Un contrôle sans transcriptase met en évidence une amplification issue d’ADN résiduel. Un contrôle interne ajouté ou endogène renseigne sur l’extraction et l’inhibition.
Le cycle de quantification, ou Cq, correspond au cycle où le signal franchit un critère défini. À efficacité comparable, un Cq plus faible traduit davantage de cible initiale, mais il ne constitue pas à lui seul une concentration. La quantification absolue repose sur un étalon caractérisé ; la quantification relative compare les échantillons après normalisation. L’efficacité d’amplification, la spécificité des amorces et la plage dynamique conditionnent ces calculs.
Le signal indique la présence d’une séquence ARN, pas nécessairement celle d’un virus infectieux. Pour l’expression génique, des gènes de référence stables dans l’espèce, les tissus et les conditions comparés réduisent les biais de normalisation. Les recommandations MIQE 2.0 couvrent la caractérisation des échantillons, des essais, des contrôles et de l’analyse afin de rendre les résultats interprétables et reproductibles. La notation RT-qPCR réserve ici « RT » à la transcription inverse et évite sa confusion avec « temps réel ».
